Цитотоксичность и генотоксичность трех универсальных стоматологических адгезивов: исследование in vitro.

Int J Mol Sci. 2020 May 31;21(11):3950. doi: 10.3390/ijms21113950

Adam Wawrzynkiewicz ¹, Wioletta Rozpedek-Kaminska ¹, Grzegorz Galita ¹, Monika Lukomska-Szymanska ², Barbara Lapinska ², Jerzy Sokolowski ², Ireneusz Majsterek ^1,*

¹Department of Clinical Chemistry and Biochemistry, Medical University of Lodz, 90-419 Lodz, Poland; adam.wawrzynkiewicz@stud.umed.lodz.pl (A.W.); wioletta.rozpedek@umed.lodz.pl (W.R.-K.); grzegorz.galita@umed.lodz.pl (G.G.)

²Department of General Dentistry, Medical University of Lodz, 90-419 Lodz, Poland; monika.lukomska-szymanska@umed.lodz.pl (M.L.-S.); barbara.lapinska@umed.lodz.pl (B.L.); jerzy.sokolowski@umed.lodz.pl (J.S.)

Correspondence: ireneusz.majsterek@umed.lodz.pl; Tel.: +48-42-272-53-00

Аннотация

Универсальные стоматологические адгезивы считаются полезным инструментом в современной стоматологии, поскольку их можно использовать в различных техниках травления, они упрощают протокол и обеспечивают достаточную прочность сцепления. Однако до сих пор нет единого мнения относительно их токсичности для пульпы. Таким образом, целью настоящего исследования было оценить цитотоксичность и генотоксичность трех универсальных адгезивов: OptiBond Universal, Prime&Bond Universal и Adhese в экспериментальной модели in vitro — линии моноцитов/макрофагов SC (ATCC CRL-9855). Цитотоксичность измеряли с помощью XTT-анализа, а генотоксичность (кометный анализ) оценивали на основе процента ДНК, присутствующей в хвосте кометы. Кроме того, способность адгезивов индуцировать апоптоз анализировали с помощью проточной цитометрии (ПЦ) с двойным окрашиванием FITC аннексином V/пропидиум йодидом (ПИ). Анализ прогрессирования клеточного цикла проводили с помощью ПЦ с использованием окрашивания ПИ. OptiBond Universal продемонстрировал значительную цитотоксичность, в то время как Prime&Bond Universal и Adhese Universal обладали минимальной цитотоксичностью и генотоксичностью по отношению к клеткам стволовых клеток человека. Более того, только OptiBond Universal увеличил уровень апоптоза в клеточной линии стволовых клеток. Ни один из адгезивов не показал значительной остановки клеточного цикла, как показал анализ методом проточной цитометрии. Из-за существенных различий в токсичности в исследованиях in vitro стоматологических адгезивов существует большая потребность в дальнейших исследованиях для разработки более надежных протоколов тестирования, позволяющих стандартизировать методологию.

Ключевые слова: стоматологические материалы, универсальные стоматологические адгезивы, цитотоксичность, генотоксичность, проточная цитометрия

Введение

Адгезивная стоматология является одной из основных отраслей стоматологии, которая в основном сосредоточена на разработке материалов, обеспечивающих эффективную связь с тканями зуба. В связи с этим, стоматологические адгезивные системы приобрели популярность во всем мире и в настоящее время привлекают значительный исследовательский интерес [1,2]. Адгезия в стоматологии широко используется практически во всех стоматологических специальностях, поскольку адгезивная стоматология является важнейшим ключом к минимально инвазивным, эстетичным и щадящим зубопротезным реставрациям [3]. Эффективность адгезивной фиксации напрямую связана с химическим составом адгезива, правильным клиническим обращением с материалом и знанием морфологических изменений, которые могут быть вызваны различными процедурами адгезии на зубной ткани [1]. Основными компонентами адгезивных систем являются мономеры акриловой смолы, органические растворители, инициаторы, ингибиторы и иногда частицы наполнителя. Каждый из вышеупомянутых компонентов имеет специфическую функцию. Детальная характеристика химических свойств и компонентов адгезивов, а также их биологического воздействия на зубную ткань является ключом к пониманию или прогнозированию их поведения в организме. Интересно, что на основе как пропорционального состава, так и химии этих компонентов стоматологические адгезивы могут быть разделены на разные поколения [1,4]. Стоматологические адгезивы, представляющие собой многофункциональные системы, могут использоваться в качестве самопротравливающих адгезивов, адгезивов с протравливанием и промыванием или в технике селективного протравливания эмали [5,6,7,8,9]. Они широко применяются в клинической практике, однако перед выбором процедуры бондинга и адгезивной системы для живого дентина следует учитывать несколько важных факторов. В этом случае необходимо сочетать долговечность реставрации, отсутствие вторичного кариеса и повреждения пульпы как из-за высвобождающихся мономеров, так и из-за бактерий и их продуктов, которые могут проникать в формирующиеся зазоры между материалом и стенками полости [1]. Производители продолжают изменять состав и свойства стоматологических адгезивов для увеличения долговечности реставрации. К основным факторам, влияющим на прочность сцепления стоматологических адгезивов, относятся не только тип растворителя, химические компоненты, их молекулярная масса или pH, связанный с надлежащей подготовкой поверхности зуба, но и дополнительные компоненты, добавляемые для улучшения прочности сцепления, включая сшивающие агенты коллагена, антиоксиданты и ингибиторы протеаз [10].

Постоянно растущий спрос на упрощенные адгезивные системы привел к разработке следующего поколения стоматологических адгезивов, называемых универсальными адгезивами. Однако, несмотря на то, что разработка универсальных адгезивных систем стала большим нововведением в адгезивной стоматологии, до сих пор неизвестно, можно ли использовать универсальные адгезивные системы во всех адгезивных процедурах, поскольку требуется их детальная характеристика [11]. В целом, стоматологические универсальные адгезивы можно определить как системы в одном флаконе, не требующие смешивания [12]. Универсальные адгезивы характеризуются упрощенными этапами применения и способностью к сцеплению с различными материалами и твердыми тканями зубов после соответствующей обработки поверхности [13,14]. Как правило, они состоят из сложных смесей сшитых и функциональных гидрофильных и гидрофобных мономеров в соответствующих растворителях, обычно включающих ацетон, этанол и/или воду [4]. Мономеры способны создавать химическую и микромеханическую связь с зубными субстратами [5,6]. Адгезивы состоят из специфических карбоксилатных и/или фосфатных ионных мономеров, которые облегчают связывание с кальцием, содержащимся в гидроксиапатите [15,16,17]. Помимо этого, универсальные адгезивы также содержат другие соединения, такие как бифенилдиметакрилат (BPDM), дипентаэритритол пентаакрилат фосфорнокислотный эфир (PENTA) и сополимер полиалкеновой кислоты, которые могут способствовать адгезии к структурам зуба. В универсальных адгезивах также используется комбинация мономеров, таких как гидрофобный декандиол диметакрилат (D3MA), гидрофильный 2-гидроксиэтилметакрилат (HEMA) и промежуточный бисфенол А-глицидилметакрилат (bis-GMA) [2]. Гидрофобные концы этих мономеров связываются с реставрационными материалами и образуют связи друг с другом, в то время как гидрофильные концы прилипают к твердым тканям зуба. Функциональные мономеры, присутствующие в составе адгезивов, позволяют использовать различные методы травления, а также повышают прочность сцепления. Эти функциональные мономеры, такие как метакрилоилоксидецилдигидрофосфат (МДП), N-фенил-п-фенилендиамин (фенил-П) или 4-метакрилоксиэтилтримеллитовая кислота (4-МЕТ), вступают в химическое взаимодействие с гидроксиапатитом зуба, что приводит к образованию нанослоев [8]. Нанослои, наиболее эффективно образующиеся с МДП, обладают сильной гидрофобностью. При этом их гибридный слой менее подвержен гидролизу, что повышает прочность сцепления с дентином [8,18]. Нанослои стабильных солей МДП-кальция образуются и осаждаются в различной степени и качестве в зависимости от типа адгезивной системы [8,19]. Концевые участки МДП сначала обладают гидрофильными свойствами, но становятся более гидрофобными после полимеризации и взаимодействия с дентином [9]. МДП обладает способностью связывать различные поверхности, такие как дентин [20], титан, металлические сплавы [21,22] или поликристаллическую керамику [23,24,25]. Включение силана в состав универсального адгезива упрощает процедуру цементирования. Это исключает этап силанизации при прямой или косвенной установке композитных смол, стеклокерамики, диоксида циркония или металлических реставраций [15,26].

В связи с тем, что стоматологические адгезивы находятся в непосредственном контакте с твердыми и мягкими тканями зуба, их биосовместимость чрезвычайно важна [27]. Существуют утверждения об использовании стоматологических адгезивов в непосредственном контакте с пульпой в качестве средства для прямой фиксации пульпы. При этом методе лечения стоматологические адгезивы не показали индукции образования твердых тканей по сравнению с цементами на основе Ca(OH)2 [28,29,30,31]. Также не наблюдалось экспрессии коллагена 3 типа и фибронектина, которые присутствовали в зубах, обработанных цементами на основе Ca(OH)2 [29]. По мнению Паулы и др., системы стоматологических адгезивов могут вызывать потенциальное повреждение пульпы, и они не рекомендуют использовать эти материалы в методах прямой фиксации пульпы [32]. Научные данные о биосовместимости универсальных стоматологических адгезивов противоречивы. Большинство авторов считают, что универсальные адгезивы нельзя использовать для прямой фиксации пульпы из-за сообщаемого воспаления [33,34,35]. С другой стороны, универсальные адгезивы, несмотря на упрощенные клинические процедуры и улучшенную адгезию, проявляли цитотоксическое действие на клетки человека, такие как фибробласты десны [36]. Основными раздражителями, содержащимися в стоматологических адгезивах, являются мономеры, определенное количество которых остается неполимеризованным даже после светоотверждения [37]. Компоненты адгезивных систем, такие как бис-ГМА, уретандиметакрилат (УДМА), триэтиленгликольдиметакрилат (ТЕГДМА), камфорхинон, ГЭМА и некоторые другие соединения, проявляли цитотоксичность при контакте с фибробластами млекопитающих [37]. Указанные мономеры диффундируют через дентинные канальцы в концентрациях, вызывающих токсическое воздействие на пульпу [38].

Для точного определения биологических свойств исследуемого материала в экспериментальных моделях in vitro следует использовать различные методы исследования, включая анализы цитотоксичности и генотоксичности, тесты на обнаружение апоптоза, а также оценку прогрессирования клеточного цикла. Как исследования in vitro, так и исследования in vivo дают возможность оценить различные характеристики материала [39,40,41]. Исследования, проводимые для оценки повреждения клеток [42,43,44] и генотоксичности стоматологических материалов, обычно проводятся in vitro с использованием человеческих лейкоцитов в качестве эталонного типа клеток [45,46,47]. Цитотоксичность стоматологических адгезивов широко описана в литературе с использованием анализов, основанных на восстановлении солей тетразолия, таких как наборы для определения пролиферации клеток II (XTT) и I (MTT), которые рекомендуются международными стандартами, такими как ISO 10993 [48]. В настоящее время новые парадигмы оценки безопасности продукции были установлены на основе механизмов, участвующих в цитотоксических путях, а не исключительно на гибели клеток [49]. В исследованиях биоматериалов используется несколько методов, которые включают исследование апоптоза, некроза [50,51] и анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии (ПЦ) [51,52,53]. ФК — относительно новый метод, используемый в исследованиях стоматологических материалов, и до настоящего времени лишь немногие стоматологические материалы исследовались с использованием вышеупомянутой лабораторной методики. Предыдущие исследования показали, что ФК также может быть использован для оценки антибактериальных свойств стоматологических адгезивов [54,55]. Другой метод, который использовался в недавних исследованиях, — это кометный анализ, подходящий для обнаружения повреждений ДНК на уровне отдельных эукариотических клеток. Благодаря своей высокой чувствительности он использовался для оценки генотоксичности различных агентов [56,57].

С учетом всех упомянутых аспектов, основная цель настоящего исследования состоит в детальной характеристике свойств универсальных стоматологических адгезивов в высоко стандартизированной экспериментальной модели in vitro.

Результаты

2.1. Анализ цитотоксичности универсальных стоматологических адгезивов

Результаты XTT-анализа показали значительные различия в цитотоксических свойствах элюатов исследуемых соединений. Клетки моноцитов/макрофагов периферической крови SC (ATCC CRL-9855) инкубировали с исследуемыми соединениями в течение 24 часов. Полученные результаты показали, что только OptiBond Universal значительно снижал их жизнеспособность. В случае Prime&Bond Universal и Adhese Universal значительных изменений жизнеспособности клеток не наблюдалось (Рисунок 1).

2.2. Анализ генотоксичности универсальных стоматологических адгезивов

Уровень повреждения ДНК оценивали с помощью щелочного варианта кометного анализа. Щелочной кометный анализ позволяет выявлять окислительное повреждение ДНК, одно- и двухцепочечные разрывы, а также наличие щелочно-лабильных участков. Количество повреждения ДНК оценивали на основе процента ДНК в хвосте кометы. Значительное увеличение повреждения ДНК в клеточной линии SC для OptiBond Universal наблюдалось после 24 часов инкубации. Ни Prime&Bond Universal, ни Adhese Universal не вызывали значительного повреждения ДНК в исследуемой клеточной линии (Рисунок 2).

2.3. Выявление апоптоза с помощью двойного окрашивания FITC Annexin V/PI универсальных стоматологических адгезивов

Для оценки активации апоптоза в клеточной линии SC после воздействия OptiBond Universal, Prime&Bond Universal и Adhese Universal было проведено двойное окрашивание FITC Annexin V/пропидиум йодидом (PI) с последующим анализом методом проточной цитометрии (FC). Апоптоз наблюдался у 34,96% клеток SC, обработанных 1 мкМ стауроспорина в течение 16 часов, по сравнению с контрольными клетками, культивированными в полной среде в течение 24 часов. После 24 часов инкубации апоптоз в клетках SC индуцировался только в случае OptiBond Universal (приблизительно 45% клеток находились на ранней и поздней стадиях апоптоза) (Рисунок 3). Prime&Bond Universal и Adhese Universal не вызывали значительной активации апоптотической гибели клеток в исследуемой клеточной линии. Кроме того, после воздействия каждой из протестированных адгезивных систем не наблюдалось увеличения количества некротических клеток.

2.4. Анализ прогрессии клеточного цикла с помощью окрашивания PI универсальных стоматологических адгезивов

Распределение клеточного цикла клеточной линии SC, окрашенной PI, после 24-часового воздействия OptiBond Universal, Prime&Bond Universal и Adhese Universal было проанализировано методом проточной цитометрии (FC). Как и предполагалось, клеточный цикл клеток SC, подвергнутых воздействию 1 мкМ нокодазола, был остановлен в фазе G2/M. Прогрессия клеточного цикла клеток SC, обработанных исследуемыми соединениями, была аналогична прогрессии клеточного цикла клеток SC, культивируемых в полной культуральной среде. При этом ни одно из протестированных соединений не вызвало значительной остановки клеточного цикла в фазе G2/M в клетках SC (Рисунок 4).

Обсуждение

Стоматологические адгезивы необходимо исследовать с помощью высоко стандартизированной экспериментальной модели, учитывая их прямой контакт с тканями зуба. Научные данные о биосовместимости универсальных стоматологических адгезивов противоречивы. Например, ряд исследований указывает на то, что универсальные адгезивы не могут быть использованы для прямого покрытия пульпы из-за сообщаемого воспаления [33,34,58]. Тем не менее, до настоящего времени не существует исследований, оценивающих биосовместимость универсальных стоматологических адгезивных систем с использованием тестов in vitro, как это представлено в данном исследовании. Применение новых методов, таких как XTT-тест, кометный анализ, анализ уровня апоптоза и распределения клеточного цикла с помощью FC, может привести к внедрению новых стандартов тестирования в материаловедении стоматологии.

Результаты настоящего исследования биосовместимости универсальных адгезивных систем показали согласованность во всех проведенных тестах. Prime&Bond Universal и Adhese Universal продемонстрировали минимальную цитотоксичность и генотоксичность по отношению к клеткам стволовых клеток человека в колориметрическом XTT-тесте. Интересно, что OptiBond Universal продемонстрировал значительную цитотоксичность и генотоксичность по отношению к клеточной линии SC. Более того, только OptiBond Universal показал значительную способность индуцировать апоптоз в клеточной линии SC. С другой стороны, ни один из протестированных адгезивов не показал значительной остановки клеточного цикла в фазе G2/M при анализе FC. Мы предполагаем, что различия в токсичности протестированных стоматологических адгезивных систем могут быть обусловлены их составом, т.е. наличием кислых мономеров и других соединений.

Оценка биосовместимости имеет решающее значение для клинической валидации стоматологических материалов, и на сегодняшний день лишь несколько исследований изучали цитотоксичность и генотоксичность стоматологических адгезивных систем [59,60]. Исследования биосовместимости in vitro важны, а также позволяют оценивать множество образцов одновременно. Кроме того, только материалы, которые кажутся эффективными, могут быть подвергнуты анализу в экспериментальных моделях in vivo. Анализы клеточных культур обеспечивают контролируемый и воспроизводимый метод оценки и являются этически более приемлемыми по сравнению с исследованиями на животных in vivo, что более важно, результаты могут привести к значимым клиническим выводам в исследованиях биоматериалов [61,62].

Существуют различные типы клеток, которые могут быть использованы в исследованиях in vitro по цитотоксичности и генотоксичности. Большинство исследований токсичности стоматологических адгезивных систем проводились на клетках, полученных из пульпы или мягких тканей полости рта [63], тогда как оценка цитотоксичности стоматологических адгезивных систем в основном проводилась с использованием первичных иммортализованных или коммерчески доступных клеточных линий [50,51,52,59,63,64,65,66,67]. Оценка цитотоксичности и генотоксичности стоматологических материалов на основе смолы, проведенная на нескольких композитах, включая Tetric EvoCeram, Tetric EvoFlow, Filtek Ultimate, Filtek Ultimate Flow, G-aenial и G-aenial Flow, показала, что отвержденные формы этих материалов не проявляли значительной цитотоксичности и генотоксичности, в то время как неотвержденные материалы оказались токсичными для лимфоцитов человека. Авторы пришли к выводу, что это может быть связано с более высоким содержанием свободных мономеров в неотвержденных композитах [68]. В другом исследовании цитотоксичность изучалась с использованием устройства для тестирования барьера дентина и трехмерной клеточной культуры. Было показано, что адгезивы с полным протравливанием проявляли значительную цитотоксичность, которая варьировалась в зависимости от толщины дентина. Однако самопротравливающие адгезивы, использованные в исследовании, были нецитотоксичны во всех протестированных моделях толщины дентина [65]. Другие исследования проводились на линии клеток одонтобластов мыши (MDPC-23) и включали 6 адгезивных систем Adper Easy Bond, Xeno V, iBond, AdheSE One, праймер Clearfil SE и Adper Single Bond 2. Все эти адгезивы показали заметное увеличение апоптотической активности, а также при исследовании под сканирующим электронным микроскопом наблюдалось уменьшение цитоплазматической мембраны и остаточные фрагменты мембраны от мертвых клеток [51]. Некоторые другие исследования в области применения систем адгезии в эндодонтии показали значительный цитотоксический эффект многоцелевых адгезивных систем Clearfil Universal и Adper Scotchbond на линию клеток фибробластов десны человека [64].

Однако клетки, культивируемые in vitro в течение многих поколений, подвергаются геномным трансформациям и/или мутациям, и поэтому не являются надежными для исследований повреждения ДНК. Что касается генотоксичности, наиболее предпочтительными исследованиями являются исследования с использованием диплоидных клеточных линий, таких как лейкоциты человека [69]. По здравому смыслу, мы выбрали клеточную линию SC в качестве предпочтительной как для исследований цитотоксичности, так и для исследований генотоксичности, которые были проведены в данном исследовании.

В последние годы было проведено ограниченное количество исследований стоматологических адгезивных систем с использованием высокочувствительного кометного анализа, которые показали незначительное увеличение их генотоксичности в клетках крови человека [70]. Поэтому настоящие результаты нельзя сравнивать с другими исследованиями. Однако несколько исследований показали, что вымываемость компонентов стоматологических адгезивных систем после их неполного превращения может привести к повышению их цитотоксичности [52,53,63,64]. Научные данные свидетельствуют о том, что стоматологические адгезивные системы могут содержать различные комбинации и концентрации метакрилатсодержащих мономеров, таких как бис-ГМА, ТЭГДМА, ГЭМА, УДМА и ПЕНТА. Следовательно, возможно, что изменение концентраций влияет на токсичность каждого материала. Интересно, что синергетическое взаимодействие между компонентами стоматологических адгезивных систем может приводить к большему цитотоксическому эффекту, чем отдельные компоненты [71].

Предыдущие исследования показали, что бис-ГМА обладает наибольшей цитотоксичностью, за ним следуют ТЭГДМА, УДМА и ГЭМА, которые, с другой стороны, обладают умеренной цитотоксичностью [71,72,73,74,75,76]. Присутствие метакрилатсодержащих мономеров, таких как ПЕНТА и УДМА, возможно, является основным цитотоксическим фактором, обнаруженным в стоматологических адгезивных системах [77]. Бис-ГМА характеризуется относительно высокой токсичностью, тогда как из-за своей более высокой молекулярной массы он обладает низкой способностью проникать в дентин [78]. Более того, бис-ГМА подвергается гидролизу, в результате которого высвобождаются водорастворимые метаболиты, такие как метакриловая кислота. Это может привести к потере проницаемости клеточной мембраны за счет индукции высвобождения ФНО-α или изменения липидного слоя [79].

Было показано, что типичные компоненты стоматологических адгезивных систем, а также реставрационных материалов, такие как HEMA и TEGDMA, способны распространяться по дентинным канальцам и, таким образом, достигать пульпы в миллимолярных концентрациях. Даже незначительные уровни упомянутых мономеров продемонстрировали способность останавливать пролиферацию клеток пульпы [80,81]. Другие исследования также показали, что HEMA и TEGDMA вредны для одонтогенной дифференцировки стволовых клеток пульпы. Это, в свою очередь, негативно влияет на гомеостаз и восстановительные способности пульпы [82,83,84,85].

Некоторые исследования показали, что цитотоксический эффект стоматологических адгезивных систем и мономеров смолы связан с остановкой клеточного цикла на определенных фазах клеточного цикла [77,86,87]. TEGDMA вызывал снижение скорости пролиферации в фибробластах десны человека, вызывая остановку клеточного цикла в фазе G2/M [87]. Наше исследование не показало значительной остановки прогрессии клеточного цикла, несмотря на то, что оцениваемые универсальные адгезивы содержали мономеры, которые продемонстрировали способность останавливать прогрессию клеточного цикла в культуральной модели in vitro. В других исследованиях стоматологические адгезивы, содержащие MDP, показали различный цитотоксический эффект, варьирующийся от значительной цитотоксичности Clearfil Liner Bond 2 V по сравнению с ED Primer II [59] до умеренного цитотоксического эффекта, как показано Clearfil Protect bond [73].

Представленное исследование имеет специфическое ограничение. Модель in vitro предоставляет ограниченную информацию о количестве остаточных мономеров и других компонентов в смеси адгезивов, которые могут проникать через дентинные канальцы в пульпу зуба. На это вымывание влияют несколько переменных, включая толщину дентина, площадь открытой поверхности, наличие смазочного слоя [59,88]. Исследования in vitro не смогли воспроизвести клинические характеристики материалов, поскольку они могут присутствовать в организме в течение нескольких лет [89]. Таким образом, модель in vitro не учитывает долгосрочные эффекты, такие как распределение через дентинные канальцы к пульпе и иммунный ответ, присутствующий в тканях человека [90]. Сравнение эффекта in vitro и клинических характеристик стоматологических материалов должно быть проведено в дальнейших исследованиях. Однако, основываясь на данных, полученных в этом исследовании, мы настоятельно рекомендуем включить оценку цитотоксичности и генотоксичности in vitro в исследования биоматериалов в качестве ключевого маркера безопасности для оценки стоматологических материалов.

Материалы и методы

В настоящем исследовании были проанализированы три универсальные системы склеивания: OptiBond Universal, Prime&Bond Universal, Adhese Universal (таблица 1).

Dental bonding systems.

Название	Производитель	Активный мономер
OptiBond Universal	Kerr, Brea, CA, USA	Ацетон (30–60%), ГЭМА (5–10%), диметакрилат глицерина (1–5%), этанол (5–10%)
Prime&Bond Universal	Dentsply Sirona, Charlotte, NC, USA	Фосфорнокислотная модифицированная акрилатная смола, многофункциональный акрилат, бифункциональный акрилат, кислый акрилат, изопропанол, вода, инициатор
Adhese Universal	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	МДП, 3–10%, MCAP — метакрилированный полимер карбоновой кислоты, HEMA (10–25%), Bis-GMA (10–25%), D3MA (3–10%), 2-диметиламиноэтилметакрилат (1–2,5%), камфорхинон (1–2,5%), этанол (10–25%)

4.1. Подготовка клеточной линии и элюата

Все исследования проводились в экспериментальной модели in vitro с использованием коммерчески доступной линии моноцитов/макрофагов периферической крови — SC (ATCC CRL-9855), приобретенной в Американской коллекции типовых культур (ATCC; Манассас, Вирджиния, США). Культивирование клеток проводилось в стандартных условиях (37 °C; 5% pCO2; 95% влажности) в соответствии с рекомендациями поставщиков. Клетки культивировали в модифицированной среде Дульбекко Искова (IMDM) с 4 мМ L-глутамина, доведенной до концентрации 1,5 г/л бикарбоната натрия, и дополненной 0,05 мМ 2-меркаптоэтанолом, 0,1 мМ гипоксантином и 0,016 мМ тимидином (90%); фетальной бычьей сывороткой (10%).

В пробирки Эппендорф с круглым дном помещали по 50 мкл каждой исследуемой системы для дентальной адгезии и полимеризовали (светодиодная лампа с интенсивностью более 1000 мВт/см2, The CURE-TC-01, Spring Health Products, PA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавляли 1 мл среды и инкубировали в течение 24 часов при 37 °C. Полученный элюат после центрифугирования готовили для дальнейших экспериментов.

4.2. Анализ цитотоксичности

Цитотоксичность исследуемых соединений измеряли с помощью колориметрического анализа XTT (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). XTT используется для оценки жизнеспособности клеток в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала. Активно метаболизирующие клетки восстанавливают тетразолиевую соль (XTT) до оранжевого водорастворимого формазана. Все эксперименты проводили в трех повторениях с аналогичными результатами. Образцы для анализа готовили в 96-луночных планшетах, добавляя до 50 мкл (8 × 10³ клеток/лунка) клеточной суспензии в полной культуральной среде и 50 мкл приготовленного элюата. Положительный контроль представлял собой клетки, суспендированные в 96% изопропиловом спирте, высокие концентрации которого высокотоксичны для клеток и приводят к их лизису, тогда как отрицательный контроль представлял собой клетки, культивируемые в полной культуральной среде. Анализируемые образцы инкубировали в течение 24 часов. Затем в каждую лунку добавляли 25 мкл смеси XTT/PMS. После 4 часов инкубации измеряли абсорбцию при длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра Synergy HT (BioTek).

4.3. Оценка генотоксичности

Генотоксичность анализируемых соединений оценивали с помощью кометного анализа. Кометный анализ — это чувствительный и быстрый метод количественной оценки и анализа повреждения ДНК в отдельных клетках. Анализы проводили в 12-луночных планшетах, добавляя 5 × 10⁴ клеток в 500 мкл полной культуральной среды и 500 мкл предварительно приготовленных элюатов. В качестве положительного контроля использовали клетки, суспендированные в 100% ДМСО (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США), высокие концентрации которого высокотоксичны для клеток и приводят к их лизису, а в качестве отрицательного контроля — клетки, суспендированные в 1 мл полной культуральной среды. Все образцы инкубировали в течение 24 часов. Клеточную суспензию в 0,37% LMP-агарозе (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) помещали на предметные стекла микроскопа, предварительно покрытые NMP-агарозой (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США). Препараты инкубировали в лизисном буфере при pH 10 (2,5 М NaCl, 10 мМ Tris, 100 мМ EDTA), содержащем TritonX-100 (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) в конечной концентрации 1%, при 4 °C в течение 60 мин. После 1 ч инкубации препараты инкубировали 20 мин в буфере для проявления (300 мМ NaOH, 1 мМ EDTA) при 4 °C, после чего проводили электрофорез (32 мА, 17 В, 20 мин) при 4 °C в электрофоретическом буфере (30 мМ NaOH, 1 мМ EDTA). После окрашивания флуоресцентным красителем DAPI препараты анализировали под флуоресцентным микроскопом. Повреждение клеток оценивали по проценту ДНК в хвосте кометы.

4.4. Выявление апоптоза

Апоптотическую гибель клеток, индуцированную фильтратами исследуемых соединений, оценивали с помощью набора для выявления апоптоза FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, приобретенного у BD Pharmingen™ (ApoAlert Annexin V, Clontech, Калифорния, США). Этот метод основан на высоком сродстве Annexin V к фосфатидилсерину, который в результате индукции апоптоза перемещается во внешние части клеточной мембраны, а также к пропидиум йодиду (PI), являющемуся маркером проницаемости клеточной мембраны. Клетки SC (1 × 10⁶ клеток/лунка), высаженные на 12-луночные планшеты, инкубировали с предварительно приготовленными фильтратами соединений, разведенными в соотношении 1:1 со средой, в течение 24 часов. Клетки, обработанные стауроспорином (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) в концентрации 1 мкМ в течение 16 ч, составляли положительный контроль, тогда как отрицательный контроль представлял собой клетки, суспендированные в полной культуральной среде и инкубированные в течение 24 ч. Затем клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) и дважды окрашивали аннексином V в качестве маркера раннего апоптоза и пропидиум йодидом (PI) в качестве маркера разрушения клеточной мембраны, некроза и позднего апоптоза. Процентное содержание апоптотических клеток анализировали методом проточной цитометрии с использованием прибора Beckman Coulter CytoFLEX. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Kaluza analysis 1.5 A (Beckman Coulter).

4.5. Анализ клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводили методом проточной цитометрии с использованием окрашивания пропидиум йодидом (PI). Клетки высевали на 12-луночные планшеты (1 × 10⁶ клеток/лунка) и инкубировали с предварительно приготовленным элюатом соединений, разбавленным в соотношении 1:1 со средой, в течение 24 часов. Клетки, обработанные 1 мкМ нокодазола (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) в течение 16 часов, служили положительным контролем, тогда как клетки, культивированные в полной среде в течение 24 часов, служили отрицательным контролем. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США) и фиксировали ледяным 70% этанолом при −20 °C в течение 20 минут. Затем клетки обрабатывали РНКазой А, не содержащей ДНКазы и протеазы (10 мг/мл) (Canvax Biotech, Испания), и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа перед окрашиванием раствором PI (10 мкг/мл) (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури, США). После 30-минутной инкубации при 4 °C процент распределения клеточного цикла в каждой фазе оценивали методом проточной цитометрии с использованием прибора Beckman Coulter CytoFLEX.
4.6. Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни в программе Sigma Plot (Systat Software, Inc.). Каждый из анализов в отдельных экспериментах основывался на результатах трех независимых тестов. Различия на графиках считались статистически значимыми следующим образом: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с отрицательным контролем.

Выводы

Можно заключить, что универсальные адгезивные системы различаются как по цитотоксическому, так и по генотоксическому воздействию на клетки периферической крови человека (моноциты/макрофаги SC). Prime&Bond Universal и Adhese Universal показали минимальное токсическое воздействие на клетки SC человека, в то время как OptiBond Universal продемонстрировал значительное цитотоксическое и генотоксическое воздействие на клеточную линию SC. Кроме того, только OptiBond Universal показал значительную способность индуцировать апоптоз в клеточной линии SC. Ни одно из соединений не показало способности останавливать клеточный цикл в фазе G2/M. Исследования цитотоксичности и генотоксичности стоматологических адгезивных систем различаются по методологии и дают разные результаты. Поэтому существует большая потребность в разработке более надежных протоколов тестирования, подходящих для проведения стандартизированных исследований различных стоматологических материалов, включая стоматологические адгезивные системы. Согласно нашим результатам, исследования биологического воздействия стоматологических адгезивных систем следует проводить с использованием различных тестов, включая исследования цитотоксичности, генотоксичности, обнаружения апоптоза и анализа клеточного цикла. Колориметрические тесты, основанные на метаболизме клеток, могут не давать надежных результатов, поскольку универсальные стоматологические адгезивы изменяют цвет смеси, что может существенно повлиять на полученные результаты. Таким образом, анализ методом проточной цитометрии в исследованиях стоматологических материалов может обеспечить более точную оценку и должен быть рекомендован международными стандартами, такими как ISO. Следовательно, настоящее исследование является первым, в котором оцениваются стоматологические адгезивные системы с помощью множественных тестов in vitro, а также предлагается расширить и включить в критерии стандартизации используемые в настоящее время методы исследования.

Сокращения

• BPDM бифенилдиметакрилат
• PENTA дипентаэритритол пентаакрилат фосфорная кислота эфир
• D3MA декандиол диметакрилат
• HEMA 2-гидроксиэтилметакрилат
• bis-GMA бисфенол А-глицидилметакрилат
• MDP метакрилоилоксидецилдигидрофосфат
• Phenyl-P N-фенил-п-фенилендиамин
• 4-MET 4-метакрилоксиэтилтримеллитовая кислота
• UDMA уретандиметакрилат
• TEGDMA триэтиленгликольдиметакрилат
• XTT набор для пролиферации клеток II
• MTT набор для пролиферации клеток I
• FC проточная цитометрия
• PI пропидиум йодид
• DAPI 4′,6-диамидино-2-фенилиндол
• SC линия клеток периферической крови моноцитов/макрофагов
• PBS фосфатно-буферный солевой раствор

Вклад авторов

Концептуализация: М.Л.-С., Б.Л. и И.М.; методология: И.М., В.Р.-К., А.В. и Г.Г.; формальный анализ: М.Л.-С., Б.Л. и И.М.; исследование: А.В., В.Р.-К. и Г.Г.; ресурсы: Дж.С. и И.М.; подготовка первоначального варианта текста: А.В., В.Р.-К. и Г.Г.; рецензирование и редактирование: Б.Л., М.Л.-С. и И.М.; визуализация: Г.Г.; научное руководство: М.Л.-С. и И.М.; администрирование проекта: И.М.; привлечение финансирования: Дж.С. Все авторы ознакомились с опубликованной версией рукописи и согласились с ней.

Финансирование

Данная работа выполнена при поддержке гранта Медицинского университета Лодзи, Польша №. 503/5-108-05/503-51-005-18.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирующие организации не принимали участия в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; в написании рукописи или в принятии решения о публикации результатов.

Ссылки

• 1.Milia E., Cumbo E., Jose A., Cardoso R., Gallina G. Current Dental Adhesives Systems. A Narrative Review. Curr. Pharm. Des. 2012;18:5542–5552. doi: 10.2174/138161212803307491. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 2.Sofan E., Sofan A., Palaia G., Tenore G., Romeo U., Migliau G. Classification review of dental adhesive systems: From the IV generation to the universal type. Ann. Stomatol. 2017;8:1–17. doi: 10.11138/ads/2017.8.1.001. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 3.Mante F.K., Ozer F., Walter R., Atlas A.M., Saleh N., Dietschi D., Blatz M.B. The current state of adhesive dentistry: A guide for clinical practice. Compend. Contin. Educ. Dent. 2013;34:2–8. [PubMed] [Google Scholar]
• 4.Van Landuyt K.L., Snauwaert J., De Munck J., Peumans M., Yoshida Y., Poitevin A., Coutinho E., Suzuki K., Lambrechts P., Van Meerbeek B. Systematic review of the chemical composition of contemporary dental adhesives. Biomaterials. 2007;28:3757–3785. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.04.044. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 5.Perdigão J., Sezinando A., Monteiro P.C. Laboratory bonding ability of a multi-purpose dentin adhesive. Am. J. Dent. 2012;25:153–158. [PubMed] [Google Scholar]
• 6.Hanabusa M., Mine A., Kuboki T., Momoi Y., Van Ende A., Van Meerbeek B., De Munck J. Bonding effectiveness of a new “multi-mode” adhesive to enamel and dentine. J. Dent. 2012;40:475–484. doi: 10.1016/j.jdent.2012.02.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 7.Zecin-Deren A., Lukomska-Szymanska M., Szczesio-Wlodarczyk A., Piwonski I., Sokolowski J., Lapinska B. The Influence of Application Protocol of Simplified and Universal Adhesives on the Dentin Bonding Performance. Appl. Sci. 2019;10:124. doi: 10.3390/app10010124. [DOI] [Google Scholar]
• 8.Yoshida Y., Yoshihara K., Nagaoka N., Hayakawa S., Torii Y., Ogawa T., Osaka A., Meerbeek B. Van Self-assembled nano-layering at the adhesive interface. J. Dent. Res. 2012;91:376–381. doi: 10.1177/0022034512437375. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 9.Alex G. Universal adhesives: The next evolution in adhesive dentistry? Compend. Contin. Educ. Dent. 2015;36:15–26. [PubMed] [Google Scholar]
• 10.Kaczor-Wiankowska K., Lipa S., Krasowski M., Sokołowski J., Lewusz-Butkiewicz K., Nowicka A. Evaluation of gap formation at the composite resin-tooth interface after using universal adhesives: In vitro SEM study using the replica technique. Microsc. Res. Tech. 2020;83:176–185. doi: 10.1002/jemt.23400. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 11.Carvalho A.A., Leite M.M., Zago J.K.M., Nunes C.A.B.C.M., Barata T.J.E., de Freitas G.C., de Torres É.M., Lopes L.G. Influence of different application protocols of universal adhesive system on the clinical behavior of Class I and II restorations of composite resin—A randomized and double-blind controlled clinical trial. BMC Oral Health. 2019;19:252. doi: 10.1186/s12903-019-0913-3. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 12.Cuevas-Suárez C.E., de Oliveira da Rosa W.L., Vitti R.P., da Silva A.F., Piva E. Bonding Strength of Universal Adhesives to Indirect Substrates: A Meta-Analysis of in Vitro Studies. J. Prosthodont. 2020;29:298–308. doi: 10.1111/jopr.13147. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 13.Nagarkar S., Theis-Mahon N., Perdigão J. Universal dental adhesives: Current status, laboratory testing, and clinical performance. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2019;107:2121–2131. doi: 10.1002/jbm.b.34305. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 14.Lümkemann N., Eichberger M., Stawarczyk B. Different surface modifications combined with universal adhesives: The impact on the bonding properties of zirconia to composite resin cement. Clin. Oral Investig. 2019;23:3941–3950. doi: 10.1007/s00784-019-02825-z. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 15.Papadogiannis D., Dimitriadi M., Zafiropoulou M., Gaintantzopoulou M.-D., Eliades G. Universal Adhesives: Setting Characteristics and Reactivity with Dentin. Materials. 2019;12:1720. doi: 10.3390/ma12101720. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 16.Fukegaw a D., Hayakawa S., Yoshida Y., Suzuki K., Osaka A., Van Meerbeek B. Chemical interaction of phosphoric acid ester with hydroxyapatite. J. Dent. Res. 2006;85:941–944. doi: 10.1177/154405910608501014. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 17.Van Landuyt K.L., Yoshida Y., Hirata I., Snauwaert J., De Munck J., Okazaki M., Suzuki K., Lambrechts P., Van Meerbeek B. Influence of the chemical structure of functional monomers on their adhesive performance. J. Dent. Res. 2008;87:757–761. doi: 10.1177/154405910808700804. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 18.Lukomska-Szymanska M., Sokolowski J., Lapinska B. Degradation of a hybrid layer—Review of literature. J. Stomatol. 2017;70:88–94. [Google Scholar]
• 19.Yoshihara K., Yoshida Y., Hayakawa S., Nagaoka N., Kamenoue S., Okihara T., Ogawa T., Nakamura M., Osaka A., Van Meerbeek B. Novel fluoro-carbon functional monomer for dental bonding. J. Dent. Res. 2014;93:189–194. doi: 10.1177/0022034513514447. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 20.Yoshida Y., Nagakane K., Fukuda R., Nakayama Y., Okazaki M., Shintani H., Inoue S., Tagawa Y., Suzuki K., De Munck J., et al. Comparative study on adhesive performance of functional monomers. J. Dent. Res. 2004;83:454–458. doi: 10.1177/154405910408300604. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 21.Tsuchimoto Y., Yoshida Y., Mine A., Nakamura M., Nishiyama N., Van Meerbeek B., Suzuki K., Kuboki T. Effect of 4-MET- and 10-MDP-based primers on resin bonding to titanium. Dent. Mater. J. 2006;25:120–124. doi: 10.4012/dmj.25.120. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 22.Ikemura K., Kojima K., Endo T., Kadoma Y. Effect of the combination of dithiooctanoate monomers and acidic adhesive monomers on adhesion to precious metals, precious metal alloys and non-precious metal alloys. Dent. Mater. J. 2011;30:469–477. doi: 10.4012/dmj.2010-151. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 23.Thompson J.Y., Stoner B.R., Piascik J.R., Smith R. Adhesion/cementation to zirconia and other non-silicate ceramics: Where are we now? Dent. Mater. 2011;27:71–82. doi: 10.1016/j.dental.2010.10.022. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 24.Llerena-Icochea A.E., Costa R.M., Borges A.F.S., Bombonatti J.F.S., Furuse A.Y. Bonding polycrystalline zirconia with 10-MDP-containing adhesives. Oper. Dent. 2017;42:335–341. doi: 10.2341/16-156-L. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 25.Van Meerbeek B., Yoshihara K., Yoshida Y., Mine A., De Munck J., Van Landuyt K.L. State of the art of self-etch adhesives. Dent. Mater. 2011;27:17–28. doi: 10.1016/j.dental.2010.10.023. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 26.Pashley D.H., Tay F.R., Breschi L., Tjäderhane L., Carvalho R.M., Carrilho M., Tezvergil-Mutluay A. State of the art etch-and-rinse adhesives. Dent. Mater. 2011;27:1–16. doi: 10.1016/j.dental.2010.10.016. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 27.Ergün G., Eǧilmez F., Üçtaşli M.B., Yilmaz Ş. Effect of light curing type on cytotoxicity of dentine-bonding agents. Int. Endod. J. 2007;40:216–223. doi: 10.1111/j.1365-2591.2007.01225.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 28.Nowicka A., Łagocka R., Lipski M., Parafiniuk M., Grocholewicz K., Sobolewska E., Witek A., Buczkowska-Radlińska J., Nowicka A., Lagocka R., et al. Clinical and Histological Evaluation of Direct Pulp Capping on Human Pulp Tissue Using a Dentin Adhesive System. Biomed Res. Int. 2016;2016:2591273. doi: 10.1155/2016/2591273. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 29.Fernandes A.M., Silva G.A.B., Lopes N., Napimoga M.H., Benatti B.B., Alves J.B. Direct capping of human pulps with a dentin bonding system and calcium hydroxide: An immunohistochemical analysis. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endodontol. 2008;105:385–390. doi: 10.1016/j.tripleo.2007.08.031. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 30.Silva G.A.B., Gava E., Lanza L.D., Estrela C., Alves J.B. Subclinical failures of direct pulp capping of human teeth by using a dentin bonding system. J. Endod. 2013;39:182–189. doi: 10.1016/j.joen.2012.09.022. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 31.Lu Y., Liu T., Li H., Pi G. Histological evaluation of direct pulp capping with a self-etching adhesive and calcium hydroxide on human pulp tissue. Int. Endod. J. 2008;41:643–650. doi: 10.1111/j.1365-2591.2008.01396.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 32.Paula A.B., Laranjo M., Marto C.M., Paulo S., Abrantes A.M., Casalta-Lopes J., Marques-Ferreira M., Botelho M.F., Carrilho E. Direct Pulp Capping: What is the Most Effective Therapy?—Systematic Review and Meta-Analysis. J. Evid. Based. Dent. Pract. 2018;18:298–314. doi: 10.1016/j.jebdp.2018.02.002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 33.Pereira J.C., Segala A.D., Costa C.A.S. Human pulpal response to direct pulp capping with an adhesive system. Am. J. Dent. 2000;13:139–147. [PubMed] [Google Scholar]
• 34.Galler K.M., Schweikl H., Hiller K.A., Cavender A.C., Bolay C., D’Souza R.N., Schmalz G. TEGDMA reduces mineralization in dental pulp cells. J. Dent. Res. 2011;90:257–262. doi: 10.1177/0022034510384618. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 35.Dammaschke T., Stratmann U., Fischer R.J., Sagheri D., Schäfer E. Proliferation of rat molar pulp cells after direct pulp capping with dentine adhesive and calcium hydroxide. Clin. Oral Investig. 2011;15:577–587. doi: 10.1007/s00784-010-0409-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 36.Pagano S., Lombardo G., Balloni S., Bodo M., Cianetti S., Barbati A., Montaseri A., Marinucci L. Cytotoxicity of universal dental adhesive systems: Assessment in vitro assays on human gingival fibroblasts. Toxicol. Vitr. 2019;60:252–260. doi: 10.1016/j.tiv.2019.06.009. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 37.Hanks C.T., Strawn S.E., Watahai J.C., Craig R.G. Cytotoxic Effects of Resin Components on Cultured Mammalian Fibroblasts. J. Dent. Res. 1991;70:1450–1455. doi: 10.1177/00220345910700111201. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 38.Oilo G. Biodegradation of dental composites/glass-ionomer cements. Adv. Dent. Res. 1992;6:50–54. doi: 10.1177/08959374920060011701. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 39.Murray P.E., García Godoy C., García Godoy F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated? Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 2007;12:E258–E266. [PubMed] [Google Scholar]
• 40.Schmalz G., Galler K.M. Biocompatibility of biomaterials–Lessons learned and considerations for the design of novel materials. Dent. Mater. 2017;33:382–393. doi: 10.1016/j.dental.2017.01.011. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 41.Moharamzadeh K., Brooki I.M., Van Noortr R. Biocompatibility of resin-based dental materials. Materials (Basel) 2009;2:514–548. doi: 10.3390/ma2020514. [DOI] [Google Scholar]
• 42.Ausiello P., Cassese A., Miele C., Beguinot F., Garcia-Godoy F., Jeso B.D., Ulianich L. Cytotoxicity of dental resin composites: An in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 2013;33:451–457. doi: 10.1002/jat.1765. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 43.Ergun G., Egilmez F., Cekic-Nagas I. The effect of light curing units and modes on cytotoxicity of resin-core systems. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 2010;15:e962-8. doi: 10.4317/medoral.15.e962. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 44.Willershausen I., Callaway A., Briseño B., Willershausen B. In vitro analysis of the cytotoxicity and the antimicrobial effect of four endodontic sealers. Head Face Med. 2011;7:15. doi: 10.1186/1746-160X-7-15. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 45.Baraba A., Želježić D., Kopjar N., Mladinić M., Anić I., Miletić I. Evaluation of cytotoxic and genotoxic effects of two resin-based root-canal sealers and their components on human leucocytes in vitro. Int. Endod. J. 2011;44:652–661. doi: 10.1111/j.1365-2591.2011.01869.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 46.Pawlowska E., Poplawski T., Ksiazek D., Szczepanska J., Blasiak J. Genotoxicity and cytotoxicity of 2-hydroxyethyl methacrylate. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2010;696:122–129. doi: 10.1016/j.mrgentox.2009.12.019. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 47.Di Pietro A., Visalli G., La Maestra S., Micale R., Baluce B., Matarese G., Cingano L., Scoglio M.E. Biomonitoring of DNA damage in peripheral blood lymphocytes of subjects with dental restorative fillings. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2008;650:115–122. doi: 10.1016/j.mrgentox.2007.10.023. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 48.ISO/EN10993-5 ISO 10993-5 Biological Evaluation of Medical Devices—Part 5: Tests for Cytotoxicity: In Vitro Methods. [(accessed on 30 May 2020)]; Int. Stand. ISO 2009. Available online: https://www.iso.org/standard/36406.html.
• 49.Bushnell P.J., Kavlock R.J., Crofton K.M., Weiss B., Rice D.C. Behavioral toxicology in the 21st century: Challenges and opportunities for behavioral scientists. Summary of a symposium presented at the annual meeting of the Neurobehavioral Teratology Society, June, 2009. Neurotoxicol. Teratol. 2010;32:313–328. doi: 10.1016/j.ntt.2010.02.002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 50.Tuncer S., Demirci M., Schweikl H., Erguven M., Bilir A., Kara Tuncer A. Inhibition of cell survival, viability and proliferation by dentin adhesives after direct and indirect exposure in vitro. Clin. Oral Investig. 2012;16:1635–1646. doi: 10.1007/s00784-011-0669-x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 51.Lee Y., An S.-Y.Y., Park Y.-J.J., Yu F.H., Park J.-C.C., Seo D.-G.G. Cytotoxic effects of one-step self-etching adhesives on an odontoblast cell line. Scanning. 2016;38:36–42. doi: 10.1002/sca.21236. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 52.Bianchi L., Ribeiro A.P.D., De Oliveira Carrilho M.R., Pashley D.H., De Souza Costa C.A., Hebling J. Cytotoxicity of adhesive systems of different hydrophilicities on cultured odontoblast-like cells. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2013;101:1498–1507. doi: 10.1002/jbm.b.32971. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 53.Bianchi L., Ribeiro A.P.D., De Oliveira Carrilho M.R., Pashley D.H., De Souza Costa C.A., Hebling J. Transdentinal cytotoxicity of experimental adhesive systems of different hydrophilicity applied to ethanol-saturated dentin. Dent. Mater. 2013;29:980–990. doi: 10.1016/j.dental.2013.07.006. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 54.Lukomska-Szymanska M., Konieczka M., Zarzycka B., Lapinska B., Grzegorczyk J., Sokolowski J. Antibacterial activity of commercial dentine bonding systems against E. faecalis-flow cytometry study. Materials. 2017;10:481. doi: 10.3390/ma10050481. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 55.Lapinska B., Konieczka M., Zarzycka B., Sokolowski K., Grzegorczyk J., Lukomska-Szymanska M. Flow cytometry analysis of antibacterial effects of universal dentin bonding agents on streptococcus mutans. Molecules. 2019;24:532. doi: 10.3390/molecules24030532. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 56.Collins A.R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Appl. Biochem. Biotechnol. Part B Mol. Biotechnol. 2004;26:249–261. doi: 10.1385/MB:26:3:249. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 57.Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H., Miyamae Y., Rojas E., Ryu J.C., Sasaki Y.F. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ. Mol. Mutagen. 2000;35:206–221. doi: 10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 58.Kitasako Y., Arakawa M., Sonoda H., Tagami J. Light and scanning electron microscopy of the inner surfaces of resins used in direct pulp capping. Am. J. Dent. 1999;12:217–221. [PubMed] [Google Scholar]
• 59.Koulaouzidou E.A., Helvatjoglu-Antoniades M., Palaghias G., Karanika-Kouma A., Antoniades D. Cytotoxicity of Dental Adhesives In Vitro. Eur. J. Dent. 2009;3:3–9. doi: 10.1055/s-0039-1697399. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 60.Caldas I.P., Alves G.G., Barbosa I.B., Scelza P., de Noronha F., Scelza M.Z. In vitro cytotoxicity of dental adhesives: A systematic review. Dent. Mater. 2019;35:195–205. doi: 10.1016/j.dental.2018.11.028. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 61.Williams D.F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 2008;29:2941–2953. doi: 10.1016/j.biomaterials.2008.04.023. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 62.Loison-Robert L.S., Tassin M., Bonte E., Berbar T., Isaac J., Berdal A., Simon S., Fournier B.P.J. In vitro effects of two silicate-based materials, Biodentine and BioRoot RCS, on dental pulp stem cells in models of reactionary and reparative dentinogenesis. PLoS ONE. 2018;13:e0190014. doi: 10.1371/journal.pone.0190014. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 63.Wegehaupt F.J., Lunghi N., Belibasakis G.N., Attin T. Influence of light-curing distance on degree of conversion and cytotoxicity of etch-and-rinse and self-etch adhesives. BMC Oral Health. 2016;17:12. doi: 10.1186/s12903-016-0239-3. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 64.Almaroof A., Niazi S.A., Rojo L., Mannocci F., Deb S. Evaluation of dental adhesive systems incorporating an antibacterial monomer eugenyl methacrylate (EgMA) for endodontic restorations. Dent. Mater. 2017;33:e239–e254. doi: 10.1016/j.dental.2017.01.016. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 65.Jiang R.D., Lin H., Zheng G., Zhang X.M., Du Q., Yang M. In vitro dentin barrier cytotoxicity testing of some dental restorative materials. J. Dent. 2017;58:28–33. doi: 10.1016/j.jdent.2017.01.003. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 66.Lanza C.R.M., De Souza Costa C.A., Furlan M., Alécio A., Hebling J. Transdentinal diffusion and cytotoxicity of self-etching adhesive systems. Cell Biol. Toxicol. 2009;25:533–543. doi: 10.1007/s10565-008-9110-x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 67.Cavalcanti B.N., Marques M.M. Cytotoxicity of substances leached from a conventional and a self-etching adhesive system on human pulp fibroblasts. Brazilian Dent. Sci. 2011;13:10–14. doi: 10.14295/bds.2010.v13i3/4.699. [DOI] [Google Scholar]
• 68.Rajić V.B., Želježić D., Ivanišević A.M., Verzak Ž., Baraba A., Miletić I. Cytotoxicity and genotoxicity of resin based dental materials in human lymphocytes in vitro. Acta Clin. Croat. 2018;57:278–285. doi: 10.20471/acc.2018.57.02.07. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 69.Huang F.M., Tai K.W., Chou M.Y., Chang Y.C. Cytotoxicity of resin-, zinc oxide-eugenol-, and calcium hydroxide-based root canal sealers on human periodontal ligament cells and permanent V79 cells. Int. Endod. J. 2002;35:153–158. doi: 10.1046/j.1365-2591.2002.00459.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 70.Tadin A., Galic N., Zeljezic D., Mikelic Vitasovic B., Marovic D., Kovacic I. Ex vivo evaluation of genotoxic effects of four dental adhesives on human leukocytes. J. Dent. Sci. 2013;8:37–43. doi: 10.1016/j.jds.2012.12.001. [DOI] [Google Scholar]
• 71.Sideridou I.D., Achilias D.S. Elution study of unreacted Bis-GMA, TEGDMA, UDMA, and Bis-EMA from light-cured dental resins and resin composites using HPLC. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2005;74:617–626. doi: 10.1002/jbm.b.30252. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 72.Geurtsen W., Lehmann F., Spahl W., Leyhausen G. Cytotoxicity of 35 dental resin composite monomers/additives in permanent 3T3 and three human primary fibroblast cultures. J. Biomed. Mater. Res. 1998;41:474–480. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(19980905)41:3<474::AID-JBM18>3.0.CO;2-I. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 73.Koulaouzidou E.A., Helvatjoglu-Antoniades M., Palaghias G., Karanika-Kouma A., Antoniades D. Cytotoxicity evaluation of an antibacterial dentin adhesive system on established cell lines. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2008;84:271–276. doi: 10.1002/jbm.b.30870. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 74.Huang F.M., Li Y.C., Lee S.S., Chang Y.C. Cytotoxicity of dentine bonding agents on human pulp cells is related to intracellular glutathione levels. Int. Endod. J. 2010;43:1091–1097. doi: 10.1111/j.1365-2591.2010.01779.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 75.Kusdemir M., Gunal S., Ozer F., Imazato S., Izutani N., Ebisu S., Blatz M.B. Evaluation of cytotoxic effects of six self-etching adhesives with direct and indirect contact tests. Dent. Mater. J. 2011;30:799–805. doi: 10.4012/dmj.2011-046. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 76.Volk J., Ziemann C., Leyhausen G., Geurtsen W. Non-irradiated campherquinone induces DNA damage in human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 2009;25:1556–1563. doi: 10.1016/j.dental.2009.07.009. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 77.Yeh H.W., Chang M.C., Lin C.C.P., Tseng W.Y., Chang H.H., Wang T.M., Chen Y.J., Lin C.C.P., Yang T.T., Lin L.D., et al. Comparative cytotoxicity of five current dentin bonding agents: Role of cell cycle deregulation. Acta Biomater. 2009;5:3404–3410. doi: 10.1016/j.actbio.2009.05.036. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 78.Huang F.M., Chang Y.C. Cytotoxicity of dentine-bonding agents on human pulp cells in vitro. Int. Endod. J. 2002;35:905–909. doi: 10.1046/j.1365-2591.2002.00589.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 79.Kostoryz E.L., Eick J.D., Chappelow C.C., Glaros A.G., Wetmore L., Yourtee D.M. In vitro effect of light-cure dental adhesive on IL-6 release from LPS-stimulated and unstimulated macrophages. J. Biomed. Mater. Res. 2003;65:89–94. doi: 10.1002/jbm.a.10448. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 80.Gerzina T.M., Hume W.R. Diffusion of monomers from bonding resin-resin composite combinations through dentine in vitro. J. Dent. 1996;24:125–128. doi: 10.1016/0300-5712(95)00036-4. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 81.Spagnuolo G., Mauro C., Leonardi A., Santillo M., Paternò R., Schweikl H., Avvedimento E.V., Rengo S. NF-κB protection against apoptosis induced by HEMA. J. Dent. Res. 2004;83:837–842. doi: 10.1177/154405910408301103. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 82.Altintas S.H., Usumez A. Evaluation of monomer leaching from a dual cured resin cement. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2008;86:523–529. doi: 10.1002/jbm.b.31052. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 83.Bouillaguet S., Wataha J.C., Hanks C.T., Ciucchi B., Holz J. In vitro cytotoxicity and dentin permeability of HEMA. J. Endod. 1996;22:244–248. doi: 10.1016/S0099-2399(06)80141-X. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 84.About I., Camps J., Mitsiadis T.A., Bottero M.J., Butler W., Franquin J.C. Influence of resinous monomers on the differentiation in vitro of human pulp cells into odontoblasts. J. Biomed. Mater. Res. 2002;63:418–423. doi: 10.1002/jbm.10253. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 85.da Silva J.M.F., Rodrigues J.R., Camargo C.H.R., Fernandes V.V.B., Hiller K.A., Schweikl H., Schmalz G. Effectiveness and biological compatibility of different generations of dentin adhesives. Clin. Oral Investig. 2014;18:607–613. doi: 10.1007/s00784-013-1000-9. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 86.Schweikl H., Spagnuolo G., Schmalz G. Genetic and cellular toxicology of dental resin monomers. J. Dent. Res. 2006;85:870–877. doi: 10.1177/154405910608501001. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 87.Mavrogonatou E., Eliades T., Eliades G., Kletsas D. The effect of triethylene glycol dimethacrylate on p53-dependent G2 arrest in human gingival fibroblasts. Biomaterials. 2010;31:8530–8538. doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.07.074. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 88.Elias S.T., dos Santos A.F., Garcia F.C.P., Pereira P.N.R., Hilgert L.A., Fonseca-Bazzo Y.M., Guerra E.N.S., Ribeiro A.P.D. Cytotoxicity of universal, self-etching and etch-and-rinse adhesive systems according to the polymerization time. Braz. Dent. J. 2015;26:160–168. doi: 10.1590/0103-6440201300294. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 89.Ruschel V.C., Stolf S.C., Shibata S., Chung Y., Boushell L.W., Baratieri L.N., Walter R. Three-year clinical evaluation of universal adhesives in non-carious cervical lesions. Am. J. Dent. 2019;32:223–228. [PubMed] [Google Scholar]
• 90.Wang R., Shi Y., Li T., Pan Y., Cui Y., Xia W. Adhesive interfacial characteristics and the related bonding performance of four self-etching adhesives with different functional monomers applied to dentin. J. Dent. 2017;62:72–80. doi: 10.1016/j.jdent.2017.05.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]